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建廟約於西元1752年，原的媽祖樓現址是河道附近一處供水手休息的工寮。相傳先民自大陸移居時，由湄洲攜媽祖香火到此，將香火安放在工寮閣樓上，後來離去時把香火遺置，之後往來五條港船隻常於夜間看見香火發出毫光，引導船隻平安航行，都認為是媽祖顯靈，才建廟將香火安奉於閣樓上，得名「媽祖樓」。
因為電影《總舖師》在媽祖樓廣場前大跳「今嘛沒尪」的舞蹈，加上許多重要的場景都在附近拍攝，如廟旁的愛鳳小吃部，還有電影中擁有千年醬油的王啟旦牛肉麵店，因此媽祖樓天后宮可說是近年最受遊客矚目的廟宇，讓原本安靜的小廟埕變得熱鬧非凡，至今仍有不少影迷來此朝聖，還可順遊附近信義街一帶。